健康総合科学先端研究機構(JARIHES)
次世代細胞・免疫治療学プロジェクト（江川記念 SETAプロジェクト）

肝細胞がん（肝がん）の治療としては、手術療法、肝動脈塞栓療法（TAE）、ラジオ波焼灼療法（RFA）をはじめとする局所療法、抗がん剤を用いた化学療法が施行される。肝がん診療における問題点として、早期発見して根治的局所治療が施されても極めて高い再発率を示し、単発肝がん切除後３年での再発率が72%に達している。 本研究の様にTAE実施後にRFAを実施した試験において、無再発生存率が１、３、５年後においてそれぞれ、64.5 %、40.1 %、18.0 %と報告されている。この報告では、TAEではなく抗がん剤を混ぜたTACEとして実施している。TAE実施後のRFAを実施した例においても、長期的には多くが再発していることから、再発肝がんに対する治療が繰り返されることとなり、繰り返された症例ほど生命予後が悪化するという傾向にある。

動脈塞栓術（TAE）は、動脈の中にカテーテルを通し、なるべく病変の近くまでカテーテルを進めて血管塞栓物質を注入し、目的の病変を治療する方法で、狭義でいわゆる“腫瘍の兵糧攻め”と言われる治療法である。さらに広い意味では塞栓物質を注入して血流を調整し、治療部位での薬剤分布をよくすることで薬剤の治療効果を増強させる方法である。
本試験では、この方法を更に発展させて「抗がん剤」や「樹状細胞」を治療箇所で徐放させるDDS（Drug & Dendritic cell Delivery System）を応用する新技術の臨床研究を推進する。

本試験の狙いを、がんサイクルに基づいてこれを説明する。局所治療（RFA）によってがん細胞が細胞死（アポトーシス）に陥り、抗原提示細胞つまり樹状細胞（dendritic cells）が活性化されて成熟すると、リンパ節に移動してTリンパ球の賦活化を誘導することとなる。賦活化されたTリンパ球は血管内から腫瘍組織に浸潤して、がん細胞を攻撃するものと考えられる。そこで、アポトーシスに陥った腫瘍組織に樹状細胞を追加することは、さらに強力な全身の抗腫瘍免疫を誘導することに繋がると考えられる。その結果として、肝がんの再発を単一細胞（シングルセル）レベルで阻止することができると考えている。

一連の臨床研究のまとめを示す。図表左の副作用において、樹状細胞を投与しないヒストリカルコントロール（TAE：白）に比べて、各種の樹状細胞治療によって発熱の頻度は増加したものの発熱の持続期間に延長はなく、NCI-CTCグレード３以上の有害事象はみられなかった。図表右の無再発生存率については、ヒストリカルコントロールに比べてOK432刺激した樹状細胞（OK432-DC：赤）によって著明な再発の抑制効果が観察された。これより、OK432刺激樹状細胞の投与によってがん免疫が賦活化され、再発（二次発がん）が抑制されたことが示唆された。またこれらの臨床研究の成果は、TAEによるがん細胞のアポトーシスが引き金となるCancer-Immunity Cycleにおいて、樹状細胞の投与がさらに反応を加速する方向で作用すること、そして最終的に腫瘍細胞の増殖が抑制されたものと推察された。

次に、ヒストリカルコントロール（TAE+RFA）とOK432治療例（TAE+O432-DC+RFA）の臨床背景を比較した。両群の臨床的因子、慢性肝疾患の進展度、腫瘍病期、腫瘍数、最大腫瘍径、AFP値に差異は認められなかった。

樹状細胞治療によって再発（二次発がん）が抑制された作用機序について検討した。図表の上段では、CD８陽性Ｔリンパ球についてがんペプチドへの反応性をELISPOT法で検討した。OK432刺激樹状細胞を用いた治療によって一部の抗原に対する反応が誘導された。DTH皮内反応からは、CD４陽性Ｔリンパ球が誘導されていることが示唆された。下段では、多数のサイトカイン、ケモカインについてBioPlex法を用いて観察した。

IL-９、IL-15、TNF-α、Eotaxin、MIP-1βというTh１タイプのサイトカインが樹状細胞の有無によって反応性に違いを認めた。つまり、樹状細胞を投与していないヒストリカルコントロール（白）では低下しているのに対して、OK432-樹状細胞の投与（赤）によって増加する方向に変化していることが分かった。これに対して、IL-４、IL-10などのTh２サイトカインは変化しなかった。また、治療後には抗腫瘍免疫に抑制的に作用する骨髄由来抑制細胞（MDSC）の活性が低下傾向を示した。これらの結果から、OK432-樹状細胞によってTh１タイプの免疫反応が誘導されるとともに、免疫抑制系の作用が軽減されることによって抗腫瘍効果が発揮された可能性が示された。
以上の研究成果から、末梢血から誘導培養された樹状細胞を肝がんの局所治療部位に投与する手法は、Tリンパ球を介して全身の抗腫瘍免疫を増強する効果を発揮し、新たながんの発生（再発：二次発がん）を抑制する治療手段となる可能性が示唆された。

従来の免疫細胞治療を実施するにあたり、免疫機能が低下した癌患者からは、治療に十分な数の活性化リンパ球（LAK）を培養増殖させることが困難であることに加え、がん細胞がもつ様々な「免疫から逃れるしくみ」によって、投与したLAKに効果が得られないことが、臨床応用における課題となっています。このような状況の中、遺伝子工学的手法を用いたキメラ抗原受容体（CAR:Chimeric antigen-receptor）を発現させた遺伝子改変T細胞療法によって、これらの課題を解決することが期待されます。

①構造
CARの基本構造は、１）抗体の中で標的を認識し、特異的に結合する部位（scFv）、２）細胞膜貫通部位および３）細胞活性化を担う部位（CD３ζ鎖）の３つの部位をもつキメラタンパク※１からなります（第１世代）。現在は、T細胞の活性化を増強するための部位（CD28、41BBのどちらか一方、あるいはその両方）を組み込まれた第２世代、第３世代のCARへと改良が進んでいます。

※1 キメラタンパク：遺伝子組換え技術により、異なるタンパク質を結合させたもの

②CARの特徴
CARは、標的に結合する部位（scFv）を変えることで、様々な標的に対する特異的な攻撃性を細胞障害性T細胞(CTL)に付与することが出来ます。また、抗体の標的を認識する特性を利用し、がん細胞のMHCに関係なく標的を認識できるため、従来のCTLでは認識できないMHCを発現しないがん細胞に対しても働くことが可能です。さらに、従来のCTLと比較して標的に対する特異性と結合する能力に優れており、高い腫瘍集積性(標的を見つけて、攻撃するために結合する能力）が期待されます。

③CAR-T細胞療法
患者から採取した末梢血単核球を抗CD3抗体とIL2※2存在下で培養した後、活性化T細胞にウイルスベクターを用いてCAR遺伝子（DNA）を導入します。遺伝子導入後も、数日間の培養を必要とします。
※２ 抗CD３抗体、IL２：T細胞の活性化、増殖に必要な因子

【国外(米国)】
白血病やリンパ腫等を対象としたCD19特異的CAR療法と神経芽腫を対象としたGD２特異的CAR療法の臨床試験が最も進んでおり、顕著な有効性を示す報告例もあり

CAR-T細胞を用いた治療での問題点は、以下の３つが挙げられます。
①高い治療効果が期待される反面、重篤な自己免疫疾患（サイトカイン放出症候群等）を引き起こすリスクも要している（死亡例あり）
②CARの標的となる抗原の多くは、細胞内にいる抗原であり、CARでは認識されにくい
③CARの標的となる抗原は、癌種によって異なるため、癌種（患者）毎に特異的なscFv（標的を認識する部位）を使い分けなくてはいけない

滉志会では、大阪大学と共同で、「血管内皮増殖因子受容体（VEGFR２」を標的とするCARを発現したCTL（CAR-T）の作製と、その臨床応用を目指した研究開発を進めています。

【特徴】
flk１特異的に結合する部位（scFv）＋細胞膜貫通部位＋細胞活性化を担う部位（CD28及びCD3ζ）からなるCAR（第2世代）のmRNAをエレクトロポレーション（EP）法※３でT細胞に導入
※3 エレクトロポレーション（EP）法：細胞に電気刺激を与えて一時的に小さな穴を開け、そこからmRNAやタンパク質等を入れる技術

ヒト免疫系は、体内に侵入してきた細菌や毒素のみならず、がんなどの生体内に発現した疾患に対しても身体を防御するシステムを有している。このシステムは、「cancer immunity cycle（がん免疫サイクル）」（Chen and Mallman, 2013)⁽¹⁾と呼ばれており、これまでの研究成果により、ヒト免疫系は下記のようなプロセスでがん細胞を排除していることが分かってきている。

1. 腫瘍細胞に発現している変異抗原を樹状細胞が貪食して認識する。
2. 樹状細胞は認識した抗原を T 細胞に提示し、細胞傷害性 T 細胞（CTL）の活性化を誘導する。
3. 活性化したCTLが腫瘍微小環境に浸潤する。
4. CTLが腫瘍細胞を認識し、結合する。
5. 腫瘍細胞に結合したCTLが細胞傷害物質（グランザイムやパーフォリン）を放出すること等により、腫瘍細胞にアポトーシスを引き起こす。
6. アポトーシスを誘導された腫瘍細胞は変異抗原と腫瘍関連抗原（TAA）を放出する。これらの抗原を樹状細胞が認識することで、さらに免疫サイクル（１.～６.）が活性化する。

がん免疫サイクルにおいてCTLの増強・活性化をもたらす免疫細胞療法と、このサイクルが機能する上での障壁（免疫チェックポイント）を除外する作用をもつ免疫チェックポイント阻害薬を併用するによって、治療効果の上乗せが期待される。

進行・再発固形がん患者を対象に、すでに安全性が担保されている免疫細胞療法に免疫チェックポイント阻害薬を併用した際の安全性を評価・検討する。また、副次的に有効性、免疫学的反応性、バイオマーカー探索についても評価・検討する。

近年、がん治療の分野では免疫細胞療法や免疫チェックポイント阻害薬に代表される免疫療法が注目されており、細胞傷害性T細胞（CTL）の活性化と免疫抑制因子（免疫チェックポイント等）の制御が必要とされている。一方、免疫チェックポイント阻害薬はこのような免疫抑制を解除することで間接的に抗腫瘍免疫応答を誘導し、既存の治療薬で効果のなかった患者での有効性が確認されているものの、治療効果が得られる患者は限定的であり、特にオプジーボの場合、対象となる非小細胞肺がん患者のおよそ２割と言われている^(3)(4)(5)。より有効な免疫療法確立のためには免疫応答増強と免疫抑制解除の組み合わせによるアプローチが重要であると考えられるが、このような併用療法は有効性の上乗せが期待される一方、その安全性についてはこれまでに十分な評価・検討がなされていない。そのため、治療開始前に効果が期待できる患者を判断・特定するためのバイオマーカーや、治療開始後できるだけ早期に効果の有無あるいは適切な治療期間を判定するための指標の確立が求められており、これまでに多くの研究がなされているものの⁽⁶⁾、いまだ確立されたバイオマーカー・指標はない。安全性についても、一般的に既存の抗がん剤と比べ副作用リスクは少ないとされているものの、一部では重篤な副作用も報告されており、オプジーボの使用にあたっては緊急時のバックアップ体制の完備など慎重なリスクマネジメントが求められている⁽⁶⁾。実際、同時ではないものの、免疫チェックポイント阻害薬投与後に免疫細胞療法を施行したケースで、治療との関連性は明らかではないものの死亡例が報告されており、これを受けて厚生労働省は併用療法に対する注意喚起（平成28年７月28日事務連絡）を出している。
このような背景をふまえ、より有効で安全な免疫療法の確立・普及の実現を目指し、本研究により免疫細胞療法と免疫チェックポイント阻害薬の併用療法の患者ベネフィット・リスクを科学的に評価することは、がん治療分野において非常に重要である。